Микроклональное размножение малины статья

Микроклональное размножение малины статья

Олег Сердюк,
кандидат с.-х. наук,
Киев, Украина

Малина черная: новая ягода в промышленных масштабах

Чёрная малина (Rubus occidentalis) имеет большой потенциал быть высокодоходной ягодной культурой для производителей продукции садоводства [1]. В ягодах чёрной малины имеется большое количество антиоксидантов, которые способны разрушать и выводить из человеческого организма свободные радикалы и другие злокачественные молекулы, которые могут нанести ему вред [2]. В её ягодах находится большое количество витаминов, минералов, фенольных соединений, а также фитостеролов. Известно, что большинство из этих веществ способны индивидуально противостоять возникновению злокачественных опухолей.

Недавно проведённые исследования показали, что ягоды чёрной малины, которые имеют широкий спектр антиканцерогенных веществ, способных влиять на гены, которые принимают участие в развитии злокачественных опухолей. Высушенные ягоды способом вымораживания имеют вдесятеро больше концентрацию антиканцерогенных веществ, что даёт возможность иметь сильное средство для профилактики развития злокачественных опухолей. [3]. Кроме этого, ягоды чёрной малины имеют отличный вкус, сильный, присущей только ей аромат и привлекательную внешность, поэтому, они должны присутствовать в рационе каждого человека (рис. 1).

Особенно это актуально сейчас, когда количество заболевающих раком повседневно растёт и это уже стало одной из главных проблем человечества.

В нашей стране садоводы уже давно стали присматриваться к этой нетипичной для нас культуре. Первым сортом, который попал к нам и сейчас чаще всего встречается был Cumberland, ягоды которого начинают созревать в наших условиях в конце июня. Это старый, один из первых сортов, который был выведен и культивировался промышленно на территории Северной Америки. Там же, в последнее время выведены новые сорта чёрной малины, которые нашли достаточно широкое промышленное применение не только на территории создания, но и в Западной Европе. Наиболее известными сортами чёрной малины в данное время являются: Allen, Black Hawk, Bristol, Haut, Huron, Jewel, Mac Black, Munger, New Logan. Наиболее ценным из них является Jewel, ягоды которого отличаются плотностью, ароматом и окраской. Его растения сильно развиты, имеют пряморослые стебли, зимостойкие и очень продуктивные. Этот сорт является более устойчивым к заболеваниям, чем другие, включая стойкость к антракнозу.

Практической ценностью черной малины является дружное созревание ягод. Поэтому их легко убирать с помощью комбайна, или же вручную за один, максимум два прохода. Это значительно экономит расходы на уборку урожая, а благодаря высокой плотности ягод их можно транспортировать без потерь на значительные расстояния. Охладив ягоды сразу же после уборки, они могут достаточно долго хранится в холодильнике или же ждать своего покупателя на полке магазина. Раз попробовав, человек обязательно захочет отведать их снова, так как они непревзойденные по вкусу и аромату.

Ягоды чёрной малины пригодны для изготовления продуктов высокого качества, таких как варенья, соки, наполнители к молочным продуктам и мороженного, свежезамороженные ягоды индивидуально и фруктово-ягодные смеси. Порошок, сделанный из высушенных ягод путём вымораживания воды из них, служит незаменимой биологически активной добавкой в ежедневном рационе человека.

К тому же, есть разновидность данного вида малины с жёлтой окраской ягод. Его растения имеют схожие с малиной чёрной хозяйственно-биологические особенности и созревают в один и тот же период. Ягоды имеют отличный вкус и аромат, а также плотную структуру (рис. 2).

Кроме употребления в свежем виде и изготовления вышеперечисленных продуктов, их можно замораживать в смеси с ягодами чёрной малины, при этом получается очень привлекательный для покупателя свежезамороженный продукт (рис. 3).

Как и все культурные растения, чёрная малина имеет своих вредителей и болезни. В отличие от малины красной (Rubus idaeus) ягоды малины чёрной в наших условиях не повреждаются личинками малинно-земляничного долгоносика и малиного жука, что является очень ценным для промышленного производства признаком и, в общем, вредителей, которые наносили бы вред в большой степени, не обнаружено.

Для растений чёрной малины, которые способны нанести большой вред, при этом значительно снизить продуктивность и сократить продолжительность жизни насаждений, или как ещё принято называть “вырождение” насаждений малины, существует две болезни. Одна из них, это увядание, которое вызывается развитием гриба Verticillium alba-atrum.

Другая — комплексная болезнь, как принято её называть Малиновый мозаичный болезненный комплекс, причиной развития — есть вирусы ежевичного некроза, жёлтая сетчатость листьев рода Rubus и/или малиновая крапчатость листьев. Вертицилёзное увядание растений невозможно контролировать с помощью химических или же агротехнических приёмов. Однажды заселившись, гриб данного заболевания способен находится в почве на протяжении длительного периода. Развитие данной болезни сопровождается увяданием растений или же отдельных стеблей, что, в конечном итоге, приводит к полной гибели растения, от чего снижается урожайность насаждений. Наиболее склонны к заражению данным заболеванием насаждения, размещенные на плохо дренированных почвах.

Малиновый мозаичный болезненный комплекс, который ассоциируется с тремя вышеупомянутыми вирусами, способен в значительной степени снижать рост и развитие растений, при этом значительно понижать их продуктивность. Переносчиками данного комплекса вирусов являются тли, поэтому необходимо контролировать наличие данного вредителя на насаждениях чёрной малины.

Для создания высокопродуктивных насаждений чёрной малины необходимо приобретать высококачественный посадочный материал; плохой посадочный материал, сразу же снижает потенциальную продуктивность насаждений. Наиболее высококачественным является безвирусный “сертифицированный” посадочный материал, которые лучше всего приобретать в питомниках, которые имеют хорошую репутацию. Сертификация является гарантией, что посадочный материал был тестирован, и в нём не было обнаружено распространённых вирусных заболеваний. Безвирусные растения способны наиболее сильно расти и развиваться, а соответственно и давать наивысший урожай ягод. Насаждения, заложенные такими растениями, живут дольше и являются высокодоходными. Посадочный материал, выращенный путём микроклонального размножения, имеет наибольшую вероятность отсутствия вирусной инфекции (рис. 4).

В данный момент посадочный материал малины чёрной, выращенный путём микроклонального размножения in vitro, предлагается в трёх видах. Это могут быть как укоренённые микрорастения в спецконтейнерах, которые необходимо самому адаптировать к условиям in vivo в акклиматизационном комплексе и дорастить до необходимых кондиций для высадки в поле, или уже адаптированные растения в кассетах (рис. 5).

Для получения урожая ягод уже в год посадки нужно приобретать взрослые растения, выращенные в контейнерах, и которые имеют 1-2 побега замещения (рис. 6).

Малина чёрная в природных условиях размножается путём укоренения верхушечных почек побегов. К концу лета – начала осени, верхняя часть побега наклоняется к почве и на ней в месте верхушечной почки образуются корни, которые углубляются в почву, а на следующий год из неё вырастает отдельное растение. Данную особенность можно использовать для размножения чёрной малины, но это трудно применить для получения достаточного количества выровненного высококачественного посадочного материала. Это является ещё одной причиной, почему для размножения данной культуры наиболее рационально применять метод микроклонального размножения. Ведь только с его помощью можно достаточно быстро нарастить необходимое количество выровненного, высококачественного посадочного материала, достаточного для закладки промышленных насаждений (рис. 7).

Надеемся, что уже в ближайшем будущем эти ценные ягоды чёрной малины и продукты, изготовленные из них, станут доступными каждому жителю нашей страны.

Источник

Введение

Ремонтантные формы малины — уникальные ягодные растения, способные, в отличие от обычных растений малины, плодоносить на однолетних побегах. Лучшие из современных сортов ремонтантного типа обладают высокой урожайностью, крупноплодностью, экологической адаптивностью, пригодны к низкозатратным технологиям возделывания. Однако многие ремонтантные формы малины обладают низким потенциалом вегетативного размножения по сравнению с летними сортами, что затрудняет их размножение и использование в селекционном процессе [3].

Решить проблему ускоренного размножения ценного селекционного материла стало возможным благодаря применению метода клонального микроразмножения. По сравнению с традиционными способами размножения малины корневыми отпрысками, корневыми и зелеными черенками, этот способ имеет целый ряд несомненных преимуществ. Главные из них высокий коэффициент размножения и возможность оздоровления посадочного материала от ряда вредоносных микроорганизмов, в том числе и от вирусной инфекции.

За последние десятилетия в нашей стране и за рубежом были проведены многочисленные исследования по совершенствованию метода клонального микроразмножения с целью производства высококачественного посадочного материала малины [5, 14]. Выполненные работы позволили определить оптимальные сроки изолирования эксплантов, оптимизировать состав питательных сред, отработать приемы адаптации полученных растений к нестерильным условиям выращивания. В настоящее время этот метод стал рутинным при тиражировании ценного селекционного материала малины в некоторых селекционных программах [7].

Однако биологические особенности ремонтантных форм малины, связанные с их сложным межвидовым происхождением, стали причиной низкой эффективности предлагаемых биотехнологических методов размножения малины на некоторых этапах культивирования in vitro. В связи с этим возникла необходимость оптимизации процесса клонального микроразмножения новых ремонтантных форм малины.

Материалы и методы исследования

Весь селекционный материал ремонтантной малины (220 генотипов), используемый нами в работе, был создан на Кокинском опорном пункте ВСТИСП (Брянская обл.). Исследования проводились в Научно-образовательном центре биотехнологии Брянской ГСХА.

Изолирование эксплантов осуществляли в конце лета начале осени, либо в осенний период. Заготовленные побеги хранили в бытовом холодильнике, при температуре 4 °С. Сегменты стебля с почкой стерилизовали в 0,1 % растворе сулемы (HgCl2) или 0,1 % мертиолята (C9H9HgNaO,S) в течение 3 минут с последующей пятикратной промывкой в стерильной дистиллированной воде. Культивирование первичных эксплантов и последующее размножение осуществляли в модифицированной среде Мурасиге-Скуга [10] с увеличенной в 3 раза концентрацией хелата железа. На этапе введения в культуру in vitro в качестве источника цитокинина вводили 6-бензиламинопурин (6-БАП) 0,5 мг/л, тидиазурон (TDZ) в концентрации 0,05-0,2 мг/л, N-(2 хлор4-пиридил)-Ы-фепилмочевина (CPPU) в концентрации 0,2-1 мг/л. При размножения растений изучали влияние цитокининов 6-БАП в концентрациях 0,5-2 мг/л и TDZ в концентрации 0.05, 0. 1 и 0.2 мг/л.

На этапе укоренения использовали часть минеральной среды Мурасиге-Скуга. В качестве индукторов ризогенеза в среду вводили ПУК или ИМК.

Результаты и обсуждения

Оптимальным сроком введения в культуру in vitro большинства ягодных растений, в том числе и малины, является период активного роста побегов: конец мая, начало июня. Эффективность начального этапа культивирования в эти сроки выявлена и на ремонтантных формах малины [4]. Однако при введении в культуру генотипов малины in vitro в весенне-летний период возникает ряд трудностей. Во-первых, ограниченное число подходящих почек, которые можно использовать для изолирования от побегов. Так, при введении в культуру 28 новых генотипов в весенне-летний период в среднем на каждый приходилось лишь 13 эксплантов. При таком ограниченном количестве материала есть вероятность потери некоторых генотипов из-за контаминации культуры и/пли неприживаемости эксплантов. Во-вторых, у ремонтантной малины наблюдается ранняя дифференцировка почек по цветочному типу, что снижает эффективность применения стандартных методов культивирования. В-третьих, есть вероятность появления сортосмеси при заготовке побегов возобновления при загущенных посадках гибридов.

В настоящее время изолирование эксплантов ремонтантных генотипов малины проводится нами в осенний период, сразу после их селекционной оценки. Однако большинство почек у малины в это время дифференцированы по цветочному типу и при их культивировании на стандартных средах (0,2-0,5 мг/л 6-БАП) отмечается гибель большей части материала. Рост степени приживаемости эксплантов и регенерации растений при введении в культуру в осенний период удалось достичь, используя в качестве источника цитокинина производные дифенилмочевины тидиазурон и CPPU, которые в низких концентрация (0.1-0.2 мг/л) оказались более эффективными, чем фитогормоны пуринового ряда.

Введение растений малины в культуру in vitro осенью дает возможность начать размножение нужных форм сразу после проведения селекционной оценки и тем самым сократить период их размножения. При этом даже в загущенных посадках сеянцев малины интересующий селекционера генотип легко обнаружить при его плодоношении и использовать для изолирования экспланты от нераспустившихся почек с побегов замещения. Кроме этого, при изолировании крупных почек, сформировавшихся на однолетних побегах, быстрее чем в весенний период, происходит регенерация растений, а плотные ороговевшие чешуи почек надежно защищают ткани от повреждения антисептиками при стерилизации.

Установлено, что производные дифенилмочевины в определенной степени стимулируют развитие цветочных структур в условиях in vitro. Так, в зависимости от фазы дифференцировки почек, нередко отмечается появление одного или нескольких бутонов и, как исключительное явление, их распускание. Однако дальнейшего своего развития эти цветочные образования не получают и со временем усыхают, тогда как регенерировавшие побеги сохраняют активный рост.

Регенерация побегов из пазушных почек происходит по периферии их основания из запасных меристем. В среднем образуется около 2 побегов на эксплант. Нами установлено, что при использовании в качестве эксплантов цветочных зачатков возможна адвентивная регенерация из них побегов. Однако в связи с возможным появлением сомаклональных вариантов при таком типе регенерации [2] его необходимо применять лишь в исключительных случаях.

Известно, что регенерационный потенциал находится в прямой зависимости от его генотипа. Так, в ряде исследований продемонстрировано, что среди представителей рода Rubus ежевика отличается большим, чем малина, коэффициентом размножения in vitro, а также частотой регенерации при адвентивном органогенезе [12]. Среди представителей одного вида растений могут выделятся сорта как с большей, так и с меньшей регенерационной способностью. Возможно, что признаки, определяющие способность к размножению у растений in vitro, коррелируют с такими показателями в полевых условиях. Однако основа-тельных экспериментов, подтверждающих это на ремонтантных формах малины, не проводилось, несмотря на актуальность такой информации при планировании работы по тиражированию сортов с использованием культуры ткани. В наших исследованиях при включении большого количества генотипов было зафиксировано, что высокорослые, активно растущие в полевых условиях сорта ремонтантной малины сохраняют такую же способность и в условиях in vitro. Так, из межвидовых сортов ремонтантной малины большим коэффициентом размножения и способностью к ризогенезу in vitro отличается сорт Бабье лето-2, а у трудно укореняемого in vitro сорта Геракл в полевых условиях наряду с низкорослыми побегами образуется слабая по сравнению с другими сортами корневая система. Такую же аналогию можно провести между низкорослым сортом Пингвин, который отличается относительно низким коэффициентом размножения в естественных условиях, и высокорослым, активно растущим сортом Оранжевое чудо.

Среди сортов, выделенных из сотен элитных сеянцев, нами не было отмечено генотипа, который бы не поддавался удовлетворительному размножению in vitro на стандартных средах с 6-БАП (1-2 мг/л). Однако выделялись генотипы, обладающие очень низкими коэффициентами размножения (не более 2): 6-Х-Ж, 15-220-2 и 16-67-1.

Из существующих способов увеличения коэффициента размножения малины можно выделить следующие:

Не исключено, что новыми способами индукции образования дополнительных побегов могут быть и другие химические и физические факторы.

Из испытанных питательных сред, приготовленных по прописям Мурасиге-Скуга [10], Андерсона [6] и Ли и де Фоссарда [9], первая оказалась наиболее оптимальной для культивирования малины на этапах введения в культуру, собственно размножения и укоренения (1/2 часть). Среда МурасигеСкуга (МС) использовалась в большинстве случаев при размножении малины in vitro. Однако следует учитывать, что эта среда в нашей работе содержит тройную концентрацию хелата железа по сравнению с оригинальной прописью.

Среди физических факторов критическое влияние на культивирование малины in vitro оказывает температура. Высокие значения этого показателя (около 30 °С), отмечаемые в весенне-летний период в отсутствии кондиционирования, могут привести к значительным потерям растительного материала. При воздействии высоких температур происходит интенсивное выделение растительными тканями этилена и углекислоты, которые в изолированной системе in vitro накапливаются в высоких концентрациях. Этилен, являясь гормоном старения и созревания, приводит к быстрой гибели растений, особенно уже закончивших рост. В связи с этим при выращивании растений in vitro целесообразно искусственно поддерживать оптимальную температуру в культивационном помещении или избегать размножения растений в жаркие месяцы. Несомненный интерес представляет информация, связанная с определением оптимальных температур и термопериода для культивирования растений малины на каждом этапе клонального микроразмножения. В большинстве случаев в научных работах рекомендуют культивирование растений малины при температуре 20-22 °С [13].

Традиционно для индукции ризогенеза микрочеренков малины используются ауксины ИУК, ИМК и реже НУК. На средах с ИУК укореняются лишь на 30-40 % микрочеренков, и для них более эффективна ИМК (0,5 мг/л).

Для некоторых плохо укореняемых генотипов ремонтантной малины предложен метод укоренения без инкубации на средах с ауксинами. После обмакивания основания стебля в концентрированный раствор ауксинов (1мг/л) растения переносятся на безгормональную среду, что приводит к высокому уровню индукции ризогенеза до 100 %.

Перспективное направление в получении посадочного материала малины укоренение микропобегов длиной до 2 см непосредственно в субстрате, минуя стадию укоренения в пробирке. Для индукции ризогенеза нами применяется ИМК в концентрации 1 г/л в течение 1 с.

Успех укоренения определяется качеством исходных микрочеренков. Установлено, что доля укорененных растений у крупных побегов выше, чем у мелких. Поэтому между этапами размножения и укоренения вводится дополнительный этап элонгации (удлинения побегов). На нем проводят уменьшение концентрации цитокинина 6-БАП с 1-2 мг/л до 0,2-0,3 мг/л.

Для ускорения ростовых процессов в лаборатории проведен эксперимент по влиянию витаминно-минерального комплекса «Компливит» на элитные формы ремонтантной малины. Полученные результаты позволяют заключить, что введение в питательную среду МС витаминно-минерального комплекса «Компливит» (4 г/л) приводит к росту коэффициента размножения и высоты растений. Такой эффект очень важен на последнем в субкультивировании этапе элонгации для получения более крупных побегов.

Высадка размноженных растений с последующей адаптацией их к нестерильным условиям является заключительным и наиболее ответственным этапом, который определяет значительную часть успеха размножения растений in vitro. В связи с рядом особенностей пробирочных растений (слабым функционированием устьичного аппарата, отсутствием кутикулярного слоя и корневых волосков) может наблюдаться значительные потеря высаженного в субстрат материала [11]. Нами установлено, что на приживаемость растений малины большое влияние оказывают тип субстрата, его pH, влажность и температура воздуха.

В своей работе мы практикуем высадку и/или укоренение пробирочных растений в минипарниках для рассады, состоящих из общего поддона, кассет и полупрозрачной крышки, обеспечивающей высокую влажность среды. Кассеты заполняются готовым торфяным субстратом. Ежедневно проводится опрыскивание растений и полив по мере необходимости.

После одного-двух месяцев адаптации в минипарниках, укорененные растения малины с несколькими образовавшимися листочками распикировываются в ящики и помещаются в теплицу, покрытую нетканым материалом типа «Лутрасил» для адаптации к естественным условиям. В таком случае отсутствует парниковый эффект, в тоже время растения защищены от воздействия низких температур, что способствует лучшему развитию растений.

Источник

Введение

Ремонтантные формы малины — уникальные ягодные растения, способные в отличие от обычных растений малины плодоносить на однолетних побегах. Лучшие из современных сортов ремонтантного типа обладают высокой урожайностью, крупноплодностью, экологической адаптивностью, пригодны к низкозатратным технологиям возделывания. Однако многие ремонтантные формы малины обладают низким потенциалом вегетативного размножения по сравнению с летними сортами, что затрудняет их размножение и использование в селекционном процессе [3].

Решить проблему ускоренного размножения ценного селекционного материла стало возможным благодаря применению метода клонального микроразмножения. По сравнению с традиционными способами размножения малины — корневыми отпрысками, корневыми и зелеными черенками, этот способ имеет целый ряд несомненных преимуществ. Главные из них высокий коэффициент размножения и возможность оздоровления посадочного материала от ряда вредоносных микроорганизмов, в том числе и от вирусной инфекции.

За последние десятилетия в нашей стране и за рубежом были проведены многочисленные иссле-дования по совершенствованию метода клонального микроразмножения с целью производства высококачественного посадочного материала малины [5, 14]. Выполненные работы позволили определить оптимальные сроки изолирования эксплантов, оптимизировать состав питательных сред, отработать приемы адаптации полученных растений к нестерильным условиям выращивания. В настоящее время этот метод стал рутинным при тиражировании ценного селекционного материала малины в некоторых селекционных программах [7].

Однако биологические особенности ремон-тантных форм малины, связанные с их сложным межвидовым происхождением, стали причиной низкой эффективности предлагаемых биотехно-логических методов размножения малины на не-которых этапах культивирования in vitro. В связи с этим возникла необходимость оптимизации процесса клонального микроразмножения новых ре-монтантных форм малины.

Материалы и методы исследования

Весь селекционный материал ремонтантной малины (220 генотипов), используемый нами в работе, был создан на Кокинском опорном пункте ВСТИСП (Брянская обл.). Исследования проводились в Научно-образовательном центре биотехнологии Брянской ГСХА.

Изолирование эксплантов осуществляли в конце лета — начале осени, либо в осенний период. Заготовленные побеги хранили в бытовом холодильнике, при температуре 4 °С. Сегменты стебля с почкой стерилизовали в 0,1 % растворе сулемы (HgCl2) или 0,1 % мертиолята (C9H9HgNaO,S) в течение 3 минут с последующей пятикратной промывкой в стерильной дистиллированной воде. Культивирование первичных эксплантов и последующее размножение осуществляли в модифицированной среде Мурасиге-Скуга [10] с увеличенной в 3 раза концентрацией хелата железа. На этапе введения в культуру in vitro в качестве источника цитокинина вводили 6-бен- зиламинопурин (6-БАП) 0,5 мг/л, тидиазурон (TDZ) в концентрации 0,05-0,2 мг/л, N-(2 хлор- 4-пиридил)-Ы-фепилмочевина (CPPU) в концентрации 0,2-1 мг/л. При размножения растений изучали влияние цитокининов 6-БАП в концентрациях 0,5-2 мг/л и TDZ в концентрации 0.05, 0.1 и 0.2 мг/л.

На этапе укоренения использовали часть минеральной среды Мурасиге-Скуга. В качестве индукторов ризогенеза в среду вводили ПУК или ИМК.

Результаты и обсуждения

Оптимальным сроком введения в культуру in vitro большинства ягодных растений, в том числе и малины, является период активного роста побегов — конец мая, начало июня. Эффективность начального этапа культивирования в эти сроки выявлена и на ремонтантных формах малины [4]. Однако при введении в культуру генотипов малины in vitro в весенне-летний период возникает ряд трудностей. Во-первых, ограниченное число подходящих почек, которые можно использовать для изолирования от побегов. Так, при введении в культуру 28 новых генотипов в весенне-летний период в среднем на каждый приходилось лишь 13 эксплантов. При таком ограниченном количестве материала есть вероятность потери некоторых генотипов из-за контаминации культуры и/пли не- приживаемости эксплантов. Во-вторых, у ремонтантной малины наблюдается ранняя дифферен- цировка почек по цветочному типу, что снижает эффективность применения стандартных методов культивирования. В-третьих, есть вероятность появления сортосмеси при заготовке побегов возобновления при загущенных посадках гибридов.

В настоящее время изолирование эксплантов ремонтантных генотипов малины проводится нами в осенний период, сразу после их селекционной оценки. Однако большинство почек у малины в это время дифференцированы по цветочному типу и при их культивировании на стандартных средах (0,2-0,5 мг/л 6-БАП) отмечается гибель большей части материала. Рост степени приживаемости эксплантов и регенерации растений при введении в культуру в осенний период удалось достичь, используя в качестве источника цитокинина производные дифенилмочевины — тидиазурон и CPPU, которые в низких концентрация (0.1-0.2 мг/л) оказались более эффективными, чем фитогормоны пуринового ряда.

Введение растений малины в культуру in vitro осенью дает возможность начать размножение нужных форм сразу после проведения селекционной оценки и тем самым сократить период их раз-множения. При этом даже в загущенных посадках сеянцев малины интересующий селекционера генотип легко обнаружить при его плодоношении и использовать для изолирования экспланты от нераспустившихся почек с побегов замещения. Кроме этого, при изолировании крупных почек, сформировавшихся на однолетних побегах, быстрее чем в весенний период, происходит регенерация растений, а плотные ороговевшие чешуи почек надежно защищают ткани от повреждения антисептиками при стерилизации.

Установлено, что производные дифенилмочевины в определенной степени стимулируют развитие цветочных структур в условиях in vitro. Так, в зависимости от фазы дифференцировки почек, нередко отмечается появление одного или нескольких бутонов и, как исключительное явление, их распускание. Однако дальнейшего своего развития эти цветочные образования не получают и со временем усыхают, тогда как регенерировавшие побеги сохраняют активный рост.

Регенерация побегов из пазушных почек про-исходит по периферии их основания из запасных меристем. В среднем образуется около 2 побегов на эксплант. Нами установлено, что при использовании в качестве эксплантов цветочных зачатков возможна адвентивная регенерация из них побегов. Однако в связи с возможным появлением сомаклональных вариантов при таком типе регенерации [2] его необходимо применять лишь в исключительных случаях.

Известно, что регенерационный потенциал на-ходится в прямой зависимости от его генотипа. Так, в ряде исследований продемонстрировано, что среди представителей рода Rubus ежевика отличается большим, чем малина, коэффициентом размножения in vitro, а также частотой регенерации при адвентивном органогенезе [12]. Среди представителей одного вида растений могут вы-делятся сорта как с большей, так и с меньшей регенерационной способностью. Возможно, что признаки, определяющие способность к размно-жению у растений in vitro, коррелируют с такими показателями в полевых условиях. Однако основа-тельных экспериментов, подтверждающих это на ремонтантных формах малины, не проводилось, несмотря на актуальность такой информации при планировании работы по тиражированию сортов с использованием культуры ткани. В наших исследо-ваниях при включении большого количества гено-типов было зафиксировано, что высокорослые, ак-тивно растущие в полевых условиях сорта ремон-тантной малины сохраняют такую же способность и в условиях in vitro. Так, из межвидовых сортов ремонтантной малины большим коэффициентом размножения и способностью к ризогенезу in vitro отличается сорт Бабье лето-2, а у трудно укореняе-мого in vitro сорта Геракл в полевых условиях наряду с низкорослыми побегами образуется слабая по сравнению с другими сортами корневая система. Такую же аналогию можно провести между низко-рослым сортом Пингвин, который отличается от-носительно низким коэффициентом размножения в естественных условиях, и высокорослым, активно растущим сортом Оранжевое чудо.

Среди сортов, выделенных из сотен элитных сеянцев нами не было отмечено генотипа, который бы не поддавался удовлетворительному размножению in vitro на стандартных средах с 6-БАП (1-2 мг/л). Однако выделялись генотипы, обладающие очень низкими коэффициентами размножения (не более 2): 6-Х-Ж, 15-220-2 и 16-67-1.

Из существующих способов увеличения коэф-фициента размножения малины можно выделить следующие:

Не исключено, что новыми способами индукции образования дополнительных побегов могут быть и другие химические и физические факторы.

Из испытанных питательных сред, приготовлен-ных по прописям Мурасиге-Скуга [10], Андерсона [6] и Ли и де Фоссарда [9], первая оказалась наиболее оптимальной для культивирования малины на этапах введения в культуру, собственно размножения и укоренения (1/2 часть). Среда Мурасиге- Скуга (МС) использовалась в большинстве случаев при размножении малины in vitro. Однако следует учитывать, что эта среда в нашей работе содержит тройную концентрацию хелата железа по сравнению с оригинальной прописью.

Среди физических факторов критическое влияние на культивирование малины in vitro оказывает температура. Высокие значения этого показателя (около 30 °С), отмечаемые в весенне-летний период в отсутствии кондиционирования, могут привести к значительным потерям растительного материала. При воздействии высоких температур происходит интенсивное выделение растительными тканями этилена и углекислоты, которые в изолированной системе in vitro накапливаются в высоких концентрациях. Этилен, являясь гормоном старения и созревания, приводит к быстрой гибели растений, особенно уже закончивших рост. В связи с этим при выращивании растений in vitro целесообразно искусственно поддерживать оптимальную температуру в культивационном помещении или избегать размножения растений в жаркие месяцы. Несомненный интерес представляет информация, связанная с определением оптимальных температур и термопериода для культивирования растений малины на каждом этапе клонального микроразмножения. В большинстве случаев в научных работах рекомендуют культивирование растений малины при температуре 20-22 °С [13].

Традиционно для индукции ризогенеза микро-черенков малины используются ауксины ИУК, ИМК и реже НУК. На средах с ИУК укореняются лишь на 30-40 % микрочеренков, и для них более эффективна ИМК (0,5 мг/л).

Для некоторых плохо укореняемых генотипов ремонтантной малины предложен метод укоренения без инкубации на средах с ауксинами. После обмакивания основания стебля в концентрированный раствор ауксинов (1мг/л) растения переносятся на безгормональную среду, что приводит к высокому уровню индукции ризогенеза — до 100 %.

Перспективное направление в получении по-садочного материала малины — укоренение микро-побегов длиной до 2 см непосредственно в субстрате, минуя стадию укоренения в пробирке. Для индукции ризогенеза нами применяется ИМК в концентрации 1 г/л в течение 1 с.

Успех укоренения определяется качеством ис-ходных микрочеренков. Установлено, что доля укорененных растений у крупных побегов выше, чем у мелких. Поэтому между этапами размножения и укоренения вводится дополнительный этап элонгации (удлинения побегов). На нем проводят уменьшение концентрации цитокинина 6-БАП с 1-2 мг/л до 0,2-0,3 мг/л.

Для ускорения ростовых процессов в лаборатории проведен эксперимент по влиянию вита- минно-минерального комплекса «Компливит» на элитные формы ремонтантной малины. Полученные результаты позволяют заключить, что введение в питательную среду МС витамин- но-минерального комплекса «Компливит» (4 г/л) приводит к росту коэффициента размножения и высоты растений. Такой эффект очень важен на последнем в субкультивировании этапе элонгации для получения более крупных побегов.

Высадка размноженных растений с последующей адаптацией их к нестерильным условиям является заключительным и наиболее ответственным этапом, который определяет значительную часть успеха размножения растений in vitro. В связи с рядом особенностей пробирочных растений (слабым функционированием устьичного аппарата, отсутствием кутикулярного слоя и корневых волосков) может наблюдаться значительные потеря высаженного в субстрат материала [11]. Нами установлено, что на приживаемость растений малины большое влияние оказывают тип субстрата, его pH, влажность и температура воздуха.

В своей работе мы практикуем высадку и/или укоренение пробирочных растений в минипарниках для рассады, состоящих из общего поддона, кассет и полупрозрачной крышки, обеспечивающей высокую влажность среды. Кассеты заполняются готовым торфяным субстратом. Ежедневно проводится опрыскивание растений и полив по мере необходимости.

После одного-двух месяцев адаптации в ми-нипарниках, укорененные растения малины с не-сколькими образовавшимися листочками распи-кировываются в ящики и помещаются в теплицу, покрытую нетканым материалом типа «Лутрасил» для адаптации к естественным условиям. В таком случае отсутствует парниковый эффект, в тоже время растения защищены от воздействия низких температур, что способствует лучшему развитию растений.

Источник